荧光显微成像技术简介

 

1. 荧光

荧光是当分子受到光激发时,电子从基态跃迁到不稳定状态的激发态,电子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态并发出辐射的光。荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况,也就是不同波长的激发光的相对效率;发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况,也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。

Jablonski能级图

受到光激发的分子,电子从基态跃迁到激发态,电子在吸收光的能量后,可能到达第一激发态的高振动能级或第二激发态,这个时候电子会经历内转换或驰豫振荡过程到达第一激发态的最低振动能级。由于激发态是不稳定状态,电子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态并发出辐射。

奎宁荧光光谱

荧光光谱具有三个特点:发射光谱与激发能无关;镜像规则:发射光谱通常是吸收光谱的镜像;斯托克斯位移:与荧光发射跃迁相关的能量通常小于吸收能量。

2. 基本结构

传统的光学显微镜是基于宏观样品特征,如相位梯度,光吸收和双折射等,因此只能成一个宏观整体的像。

光学显微镜

将荧光光谱技术利用到显微成像技术上可以基于样本发射荧光的特性对单个分子物质的分布进行成像,监测细胞内部特定荧光团标记的成分的确切位置以及相关的扩散系数、转运特性、或与其他生物分子的相互作用等。

荧光显微镜

典型的荧光显微镜是利用汞弧灯作为激发光源并配合使用一组特定的滤光片及二向色镜来对样本进行高效率的照明同时分离出微弱的荧光信号,其成像系统结构如上图所示。荧光显微镜主要利用了荧光探针的高度特异性,它能够在复杂的混合物中选择性地探测浓度非常低的荧光标记目标。此外,由于荧光的高灵敏度和空间分辨率使得荧光显微镜能够在衍射受限的光学分辨率下的长度范围内对单个分子精确定位。

荧光显微镜结构示意图

3. 主要类别

3.1 宽场荧光显微镜

最常见的荧光显微成像技术就是传统的宽场荧光显微镜,但它只能对事先切片的样品进行成像,不具备光学切片能力,对于厚度大于2微米的三维样品,宽场照明会使得整个样品体积内的荧光标记发射荧光,这些离焦光会遮掩焦面上的细节从而极大降低了对比度。

3.2 结构光照明显微成像技术

宽场荧光显微镜低对比度的问题可以通过在系统中加入结构光照明调制来解决,如正弦条纹照明装置,这样就可以通过算法重建得到光学切片图像,这种方法结构简单容易实现且成像速度较快。

结构光照明显微成像技术示意图

3.3 激光扫描共聚焦显微镜

另一种荧光显微成像技术是激光扫描共聚焦显微镜,它是目前使用最广泛的光学切片技术,其系统结构如下图所示。它是通过使用聚焦的激光束扫描样本,并在探测器前放置一个可调节的针孔滤除离焦的杂散荧光来获得样品的光学切片图像。相比于传统的宽场荧光显微镜,激光扫描共聚焦显微镜具有一个放置在与中间像面及物面共轭的平面上的共聚焦针孔,因此探测器只能探测到通过针孔的荧光信号。

激光扫描共聚焦显微镜示意图

由于背景荧光的减少以及信噪比的大幅提高使得共聚焦荧光显微镜的成像质量大大优于宽场荧光成像技术,同时其非侵入式的共聚焦光学切片技术能够在各种条件下对活体样本或固定样本进行三维成像,且清晰度更高。但由于其是点扫描式成像,其成像速度较慢。此外,共聚焦扫描显微镜大多使用激光作为光源激发样品荧光,激光的激发波长十分有限,并且频带较窄,同时高强度的激光辐射容易对生物组织产生破坏。而传统的荧光显微镜使用汞弧灯或氙灯可以在紫外波段、可见光波段及近红外波段提供完整的激发波长光谱范围。

宽场(上)与共聚焦(下)成像对比

3.4 双光子荧光显微成像技术

双光子激发荧光过程是一个荧光分子同时吸收两个长波激发光子,发出一个短波荧光光子,属于非线性过程。双光子激发需要高功率激发光源和高光子密度,只有在焦点处的微小区域内样品才能够吸收足够的能量而发出荧光。其激发光源为近红外或红外,因而光漂白和光损伤小(只在焦平面上有损伤,且长波长光对细胞毒性小),具有高成像灵敏度(激发波长离荧光波长比较远,可以最大限度的收集荧光),且探测深度深(样品对激发光散射弱)。

双光子荧光显微成像技术示意图

参考文献:

[1] 孙超伟.近红外荧光显微术用于活体组织的深层成像研究[D]. 浙江大学, 2018.

[2] Wilhelm, S., Grobler, B., Gluch, M., & Heinz, H. (2003). Confocal Laser Scanning Microscopy. Principles. Microscopy from Carl Zeiss, microspecial.

[3] Basic concept in fluorescence.

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